过氧化氢刺激人牙髓干细胞的衰老进程

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.016

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (10): 1481-1487.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.016

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

过氧化氢刺激人牙髓干细胞的衰老进程

徐克¹，冯桂娟²，冯兴梅²，黄丹²，郑科²，唐恩溢¹

1南京大学医学院，江苏省南京市 210093；2南通大学附属医院口腔科，江苏省南通市 226001

收稿日期:2016-01-24 出版日期:2016-03-04 发布日期:2016-03-04
通讯作者: 冯桂娟，医师，硕士，南通大学附属医院口腔科，江苏省南通市 226001
作者简介:徐克，男，1982年生，江苏省南通市人，汉族，2006年南通大学毕业，主治医师，主要从事口腔颌面外科及牙髓干细胞生物学特性方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金项目(81500809)

Hydrogen peroxide accelerates senescence of human dental pulp stem cells

Xu Ke¹, Feng Gui-juan², Feng Xing-mei², Huang Dan², Zheng Ke², Tang En-yi¹

¹Medical School of Nanjing University, Nanjing 210093, Jiangsu Province, China; ²Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China

Received:2016-01-24 Online:2016-03-04 Published:2016-03-04
Contact: Feng Gui-juan, Master, Physician, Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China
About author:Xu Ke, Attending physician, Medical School of Nanjing University, Nanjing 210093, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81500809

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

牙髓干细胞：2000年，Gronthos等人利用酶消化的方法，从人第三磨牙中分离出比骨髓基质干细胞具有更高克隆能力和增殖能力的牙髓干细胞。牙髓干细胞的鉴别主要依赖于它的生物学特性，包括细胞体积小、集落生成能力、高增殖能力、自我更新能力和多潜能分化能力。

细胞衰老：指由DNA损伤、氧化应激、基因表达紊乱和其他有害刺激导致的不可逆的细胞生长停滞，它包含了细胞增殖及功能的改变，细胞的衰老促进了机体的老化和相关疾病的发生。研究发现调节细胞衰老的机制有多种假说，例如端粒酶学说、DNA损伤学说、氧化应激学说等。

背景：细胞移植治疗受区存在氧化应激过程，影响疗效。研究氧化应激对牙髓干细胞的影响及机制方面的报道较少。

目的：分离培养人牙髓干细胞，分析加入过氧化氢(H₂O₂)对其衰老程度的影响。

方法：牙髓干细胞分为3组，分别用PBS、100 μmol/L H₂O₂、200 μmol/L H₂O₂刺激2 h。倒置显微镜下观察细胞形态，β-半乳糖苷酶染色观察细胞衰老程度，BrdU试剂盒和细胞计数法检测细胞增殖能力，免疫荧光检测细胞骨架排列情况和sirt1蛋白的表达，Western Blot法测定sirt1、p16蛋白的表达。

结果与结论：①牙髓干细胞呈成纤维细胞样梭形外观。②H₂O₂刺激后，细胞体积增大、β-半乳糖苷酶染色加深、细胞增殖能力降低，随着H₂O₂浓度增加，牙髓干细胞衰老增强，在此过程中，p16表达上调，sirt1表达受到抑制。③结果表明H₂O₂刺激促进牙髓干细胞衰老，sirt1、p16参与了此过程，为牙髓干细胞移植提供了理论基础和实验支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-2872-1905 (冯桂娟)

关键词: 干细胞, 培养, 牙髓干细胞, 过氧化氢, 衰老, p16, sirt1, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The process of oxidative stress that impacts the curative effect exists in the region which accepts cell transplantation. However, there are few reports about the effects of oxidative stress on human dental pulp stem cells and relevant mechanism.

OBJECTIVE: To understand the effect of hydrogen peroxide on the senescence of human dental pulp stem cells.

METHODS: Human dental pulp stem cells were isolated and cultured in PBS, 100 and 200 μmol/L hydrogen peroxide for 2 hours, respectively. Cell morphology was observed under inverted microscope, degree of cell senescence monitored by β-galactosidase staining, cell proliferation ability detected by BrdU kit and cell counting method, cytoskeleton of dental pulp stem cells and expression of sirt1 tested using immunofluorescence method, and expression of sirt1 and p16 proteins measured by western blot assay.

RESULTS AND CONCLUSION: Dental pulp stem cells exhibited a fibroblast-like morphology with spindle-shaped appearance. After stimulated by hydrogen peroxide, the cell volume was enlarged, the β-galactosidase staining deepened and the proliferation of dental pulp stem cells reduced. The enhancement of senescence of dental pulp stem cells was accompanied with the increasing concentration of hydrogen peroxide, and in this process, the expression of p16 was raised while the expression of sirt1 was decreased. In conclusion, the senescence of human dental pulp stem cells can be promoted by the stimulation of hydrogen peroxide, and sirt1 and p16 are involved in this process. Our findings may provide a theoretical and experimental foundation for autologous transplantation of dental pulp stem cells.

徐克，冯桂娟，冯兴梅，黄丹，郑科，唐恩溢. 过氧化氢刺激人牙髓干细胞的衰老进程[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(10): 1481-1487.

Xu Ke, Feng Gui-juan, Feng Xing-mei, Huang Dan, Zheng Ke, Tang En-yi. Hydrogen peroxide accelerates senescence of human dental pulp stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(10): 1481-1487.

图/表（结果） 5

2.1 H₂O₂对牙髓干细胞形态的影响原代细胞一两天贴壁，第4，5天细胞呈集落样生长，取第3代牙髓干细胞置于倒置显微镜下观察，细胞形态呈成纤维细胞样梭形外观(图1A)。经过100，200 μmol/L H₂O₂刺激2 h，细胞体积增大，变扁平，失去纺锤体样形态(图1B和C)。

2.2 H₂O₂处理牙髓干细胞后β-半乳糖苷酶活性增加 β-半乳糖苷酶试剂盒检测100，200 μmol/L H₂O₂刺激 2 h后牙髓干细胞中衰老细胞数，对照组为(18.0±2.1)%，100 μmol/L H₂O₂组为(42.0±2.4)%，200 μmol/L H₂O₂组为(79.0±2.5)%，与对照组相比，100，200 μmol/L H₂O₂刺激后β-半乳糖苷酶阳性细胞数比例显著增加(图2A-D)。

2.3 H₂O₂处理抑制牙髓干细胞增殖不同浓度H₂O₂作用对牙髓干细胞增殖影响的吸光度值检测结果见图3A。与对照组相比，随着H₂O₂浓度增加，吸光度值呈浓度依赖性降低。细胞计数法分析100，200 μmol/L H₂O₂对牙髓干细胞增殖的影响，随着H₂O₂刺激浓度增加，牙髓干细胞数降低(图3B)。

2.4 H₂O₂处理影响牙髓干细胞骨架排列细胞免疫荧光显示100，200 μmol/L H₂O₂刺激牙髓干细胞后，细胞骨架排列紊乱(图4A-C)。

2.5 H₂O₂诱导牙髓干细胞衰老后相关蛋白表达应用Western Blot检测牙髓干细胞sirt1和p16蛋白表达水平，结果显示：与对照组相比，随着H₂O₂浓度增加，sirt1表达水平呈浓度依赖性降低，p16表达水平呈浓度依赖性增高(图5A，B)。免疫荧光结果进一步验证，200 μmol/L H₂O₂刺激组牙髓干细胞中sirt1的表达水平较对照组显著下降(图6A-F)。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年10至12月在南通大学附属医院完成。

1.3 材料

1.4 实验方法

1.4.1 牙髓干细胞分离、培养、鉴定选择正畸减数拔除的健康牙齿标本，告知患者拔除的牙齿将用于提取牙髓干细胞，得到所有患者知情同意，并签署《南通大学附属医院知情同意书》。在超净台上用碘伏冲洗正畸减数拔除的健康牙齿，再用无菌生理盐水冲洗至无血迹，用咬骨钳沿釉牙骨质界打开髓腔，镊子取出牙髓，剪去根部的牙髓组织。将3 g/LⅠ型胶原酶与4 g/L分散酶以 1︰1比例混合，两种酶以1︰10的体积与剪碎的牙髓混合消化1 h，消化后的组织经1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加完全培养液(体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、DMEM)混匀、吹打，经70 µm过滤网过滤，获得的细胞悬液接种于25 cm²培养瓶，加入完全培养液，之后三四天半量换液，细胞达到70%-80%融合后，用0.25%胰蛋白酶室温消化3 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀吹打均匀，以1︰3比例传代。牙髓干细胞进行成骨、成软骨、成脂肪分化能力鉴定^[18]。

1.4.2 实验分组第1组：牙髓干细胞用PBS刺激作为对照组。第2组：牙髓干细胞用100 μmol/L H₂O₂刺激，持续时间为2 h。第3组：牙髓干细胞用200 μmol/L H₂O₂刺激，持续时间为2 h。

1.4.3 β-半乳糖苷酶染色取对照组和H₂O₂刺激组牙髓干细胞，按1×10⁵/孔接种到24孔板中，重复3孔，进行β-半乳糖苷酶染色。按照β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书进行操作：小心吸去24孔板里的培养液，每孔加入500 μL清洗液(A液)，清洗生长中的细胞表面；去除孔里的清洗液后每孔加入500 μL固定液(B液)，孵育5 min；吸去固定液，每孔加入500 μL酸性液(C液)，重复1次后去除C液，每孔加入400 μL染色液，放入37 ℃培养箱孵育5 h。在光学显微镜下观察和计数，β-半乳糖苷酶阳性细胞呈蓝色。

1.4.4 细胞计数

BrdU染色法：牙髓干细胞以3×10⁴/孔接种于6孔板内，PBS或不同浓度H₂O₂刺激2 h后，去除H₂O₂，继续用普通培养基培养24 h，用BrdU试剂盒检测增殖情况。牙髓干细胞培养液中加入100 μmol/L BrdU酶标液于37 ℃孵化4 h，移除细胞培养液，固定细胞，FixDenat溶液使DNA变性，加入抗BrdU-POD工作液，370 nm波长处测定裂解液的吸光度值，每组取6个平行样本进行统计。

细胞计数法：牙髓干细胞以3×10⁴/孔接种于6孔板内，PBS或不同浓度H₂O₂刺激2 h后，去除H₂O₂，继续用普通的培养基培养24 h，镜下观察，统计细胞数，每组取6个平行样本进行统计。

1.4.5 F-actin免疫荧光染色免疫荧光观察H₂O₂刺激后牙髓干细胞的细胞骨架变化。取牙髓干细胞进行固定，PBS清洗，血清封闭后孵育F-actin，DAPI染色液复染30 min，荧光显微镜下观察。

1.4.6 Western Blot检测sirt1和p16蛋白表达收集牙髓干细胞，用Western Blot分析sirt1和p16表达。常规裂解液裂解细胞，离心后收集上清，样品进行SDS-PAGE电泳，280 mA恒流转PVDF膜90 min，含5%脱脂奶粉缓冲液封闭，分别用一抗(兔抗人sirt1、兔抗人p16)、二抗(生物素化二抗鼠抗兔IgG)进行孵育及显色观察、扫描分析结果。

1.4.7 免疫荧光检测sirt1蛋白表达收集牙髓干细胞，用免疫荧光分析sirt1表达。分别用一抗(兔抗人sirt1)、二抗(生物素化二抗鼠抗兔IgG)进行孵育，DAPI染色液复染30 min，荧光显微镜下观察。

1.5 主要观察指标 ①牙髓干细胞形态。②牙髓干细胞β-半乳糖苷酶活性。③牙髓干细胞增殖情况。④牙髓干细胞骨架排列情况。⑤牙髓干细胞衰老相关蛋白表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 16.0软件处理，数据用 x(_)±s表示。组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

牙髓干细胞具有多向分化和高增殖能力，与骨髓间充质干细胞比较，其增殖能力、成骨分化能力和成软骨分化能力更高^[18]。牙髓干细胞不仅可以应用于牙缺失、骨缺损的修复，而且可以应用于关节炎、心脏疾病、肌肉萎缩等治疗，取得了良好的治疗效果^[19-21]。虽然牙髓干细胞的治疗已经取得了一些进展，但成功的细胞移植治疗还取决于牙髓干细胞体外培养条件和体内移植的局部微环境。损伤区的缺血、缺氧、炎细胞浸润等因素，可导致出现氧化应激状态，过量的活性氧损害细胞活性，降低其在损伤区的存活率，极大限制了牙髓干细胞的移植效率^[22-24]。

H₂O₂是活性氧簇的主要成员之一，可通过多种途径损害细胞，使细胞膜脂质过氧化，抑制蛋白质的功能，破坏核酸和染色体等^[25-26]。既往研究显示异常增高的活性氧不利于干细胞静息状态的维持和干细胞增殖，适量增加活性氧则有利于部分类型干细胞的增殖和分化。此外，干细胞内低浓度活性氧是维持其静息状态的重要保证，适当增高活性氧浓度则可促进干细胞的分化成熟与增殖，但浓度过大则会损伤细胞的脂质、蛋白质和核酸，导致细胞凋亡^[27]。此项研究采用不同浓度H₂O₂处理牙髓干细胞，观察细胞形态、β-半乳糖苷酶活性、细胞增殖活性、细胞骨架变化及其作用机制，为优化牙髓干细胞移植治疗疾病提供理论依据和实验基础。既往研究显示H₂O₂可以诱导间充质干细胞衰老^[14^，^28]。最新的研究发现100，200 μmol/L H₂O₂可以促进骨髓间充质干细胞发生衰老，400 μmol/L H₂O₂刺激导致其死亡，所以实验选择100，200 μmol/L H₂O₂刺激牙髓干细胞^[11]。细胞衰老包括两种类型：一种是细胞在体外培养过程中会逐渐到达一个增生的极限，此时细胞会停止分裂增殖，进入衰老状态，即复制性衰老；二是外界局部因素对细胞的刺激逐渐积累而导致细胞丧失了自我增殖分化或修复的功能，通常被称为早熟性衰老，主要受环境的影响^[29]。课题组利用H₂O₂短刺激牙髓干细胞使其在氧化应激作用下诱导产生早熟性衰老。衰老的细胞表现为细胞变扁平、细胞体积增大、β-半乳糖苷酶高表达、细胞周期停滞和细胞骨架紊乱^[30]，同时也会激活p16、p53等衰老信号通路的活化，进而启动衰老反应。实验结果显示，与对照组相比，H₂O₂作用2 h后牙髓干细胞体积增大，变扁平，失去纺锤体样形态。β-半乳糖苷酶活性能反映细胞溶酶体的功能状态，被公认为是细胞衰老程度的重要标志之一。实验结果表明，与对照组相比，100，200 μmol/L H₂O₂刺激后β-半乳糖苷酶阳性细胞数显著增加，牙髓干细胞呈现衰老征象。利用BrdU试剂盒和细胞计数法检测H₂O₂刺激对牙髓干细胞增殖的影响，结果显示，随着H₂O₂刺激浓度增加，牙髓干细胞数降低。

活性氧的产生可以促进DNA损伤^[31-34]。在老龄鼠的几乎所有器官都出现DNA损伤，通过p16信号通路促进细胞衰老^[35]。p16基因是衰老诱导基因，可以直接引起细胞衰老，p-Rb磷酸化，cyclinD1与cyclin依赖激酶4和cyclin依赖激酶6结合成复合体来控制细胞周期G₁期进入S期进程，而此过程可以被cyclin依赖激酶抑制剂调节，如p16蛋白^[36]。结果显示，随着H₂O₂浓度增加，p16表达水平呈浓度依赖性增高。sirt1作为组蛋白去乙酰酶，不仅调节着组蛋白去乙酰化，还调节着一些和细胞周期密切相关的基因，进而影响细胞的寿命。作为可能潜在的衰老抑制基因，它可能与其他衰老和细胞周期调控基因一样，在某种程度上通过调节多个基因，在细胞水平上调节哺乳类动物细胞生命的进程^[37]。既往研究报道sirt1基因的过表达和白藜芦醇的激活可以在WI38细胞和2BS细胞中显著降低p16基因的活性，提高Rb的磷酸化，进而增加2BS细胞传代寿命，增加了G₁期细胞的比例，细胞生长加快，延缓了衰老^[38]。研究发现sirt1/ERK/S6K1可能是衰老的原因之一，而且磷酸化的ERK/S6K1可以通过提高细胞分化抑制蛋白或DNA结合抑制蛋白的表达，降低p16的基因活性进而抑制衰老^[38]。实验结果亦发现H₂O₂刺激组牙髓干细胞sirt1表达水平呈浓度依赖性降低。

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Hydrogen peroxide accelerates senescence of human dental pulp stem cells

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